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Controlar o movimento de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro para distribuição direcionada de citostáticos
Autor Toropova Y, Korolev D, Istomina M, Shulmeyster G, Petukhov A, Mishanin V, Gorshkov A, Podyacheva E, Gareev K, Bagrov A, Demidov O
Yana Toropova,1 Dmitry Korolev,1 Maria Istomina,1,2 Galina Shulmeyster,1 Alexey Petukhov,1,3 Vladimir Mishanin,1 Andrey Gorshkov,4 Ekaterina Podyacheva,1 Kamil Gareev,2 Alexei Bagrov,5 Oleg Demidov6,71Almazov National Medical Centro de Pesquisa do Ministério da Saúde da Federação Russa, São Petersburgo, 197341, Federação Russa;2 Universidade Eletrotécnica de São Petersburgo “LETI”, São Petersburgo, 197376, Federação Russa;3 Centro de Medicina Personalizada, Centro de Pesquisa Médica do Estado Almazov, Ministério da Saúde da Federação Russa, São Petersburgo, 197341, Federação Russa;4FSBI “Instituto de Pesquisa da Gripe em homenagem a AA Smorodintsev” Ministério da Saúde da Federação Russa, São Petersburgo, Federação Russa;5 Instituto Sechenov de Fisiologia Evolutiva e Bioquímica, Academia Russa de Ciências, São Petersburgo, Federação Russa;6 Instituto de Citologia RAS, São Petersburgo, 194064, Federação Russa;7INSERM U1231, Faculdade de Medicina e Farmácia, Universidade Bourgogne-Franche Comté de Dijon, França Comunicação: Yana ToropovaAlmazov Centro Nacional de Pesquisa Médica, Ministério da Saúde da Federação Russa, São Petersburgo, 197341, Federação Russa Tel +7 981 95264800 4997069 Email [email protegido] Antecedentes: Uma abordagem promissora para o problema da toxicidade citostática é o uso de nanopartículas magnéticas (MNP) para entrega direcionada de medicamentos.Objetivo: Utilizar cálculos para determinar as melhores características do campo magnético que controla MNPs in vivo e avaliar a eficiência da entrega de MNPs por magnetron a tumores de camundongos in vitro e in vivo.(MNPs-ICG).Estudos de intensidade de luminescência in vivo foram realizados em camundongos tumorais, com e sem campo magnético no local de interesse.Esses estudos foram realizados em uma estrutura hidrodinâmica desenvolvida pelo Instituto de Medicina Experimental do Centro de Pesquisa Médica do Estado Almazov do Ministério da Saúde da Rússia.Resultado: O uso de ímãs de neodímio promoveu o acúmulo seletivo de MNP.Um minuto após a administração de MNPs-ICG a camundongos portadores de tumor, as MNPs-ICG acumulam-se principalmente no fígado.Na ausência e presença de campo magnético, isso indica sua via metabólica.Embora tenha sido observado um aumento na fluorescência no tumor na presença de um campo magnético, a intensidade da fluorescência no fígado do animal não se alterou ao longo do tempo.Conclusão: Este tipo de MNP, combinado com a intensidade do campo magnético calculada, pode ser a base para o desenvolvimento da entrega controlada magneticamente de medicamentos citostáticos a tecidos tumorais.Palavras-chave: análise de fluorescência, indocianina, nanopartículas de óxido de ferro, entrega magnetron de citostáticos, direcionamento tumoral
As doenças tumorais são uma das principais causas de morte em todo o mundo.Ao mesmo tempo, ainda existe uma dinâmica de aumento da morbimortalidade das doenças tumorais.1 A quimioterapia utilizada hoje ainda é um dos principais tratamentos para diversos tumores.Ao mesmo tempo, o desenvolvimento de métodos para reduzir a toxicidade sistêmica dos citostáticos ainda é relevante.Um método promissor para resolver seu problema de toxicidade é usar transportadores em nanoescala para direcionar métodos de administração de medicamentos, que podem fornecer acúmulo local de medicamentos em tecidos tumorais sem aumentar seu acúmulo em órgãos e tecidos saudáveis.concentração.2 Esse método permite melhorar a eficiência e o direcionamento dos quimioterápicos aos tecidos tumorais, ao mesmo tempo que reduz sua toxicidade sistêmica.
Entre as várias nanopartículas consideradas para entrega direcionada de agentes citostáticos, as nanopartículas magnéticas (MNPs) são de particular interesse devido às suas propriedades químicas, biológicas e magnéticas únicas, que garantem a sua versatilidade.Portanto, nanopartículas magnéticas podem ser utilizadas como sistema de aquecimento para tratar tumores com hipertermia (hipertermia magnética).Eles também podem ser usados ​​como agentes de diagnóstico (diagnóstico por ressonância magnética).3-5 Usando essas características, combinadas com a possibilidade de acúmulo de MNP em uma área específica, através do uso de um campo magnético externo, a entrega de preparações farmacêuticas direcionadas abre a criação de um sistema magnetron multifuncional para direcionar citostáticos para o local do tumor Perspectivas.Tal sistema incluiria MNP e campos magnéticos para controlar seu movimento no corpo.Neste caso, tanto os campos magnéticos externos como os implantes magnéticos colocados na área do corpo que contém o tumor podem ser utilizados como fonte do campo magnético.6 O primeiro método apresenta sérias deficiências, incluindo a necessidade de utilização de equipamento especializado para direcionamento magnético de medicamentos e a necessidade de treinar pessoal para realizar cirurgias.Além disso, este método é limitado pelo alto custo e só é adequado para tumores “superficiais” próximos à superfície do corpo.O método alternativo de utilização de implantes magnéticos amplia o escopo de aplicação dessa tecnologia, facilitando sua utilização em tumores localizados em diferentes partes do corpo.Tanto os ímãs individuais quanto os ímãs integrados no stent intraluminal podem ser usados ​​como implantes para danos tumorais em órgãos ocos para garantir sua patência.No entanto, de acordo com a nossa própria investigação não publicada, estes não são suficientemente magnéticos para garantir a retenção de MNP da corrente sanguínea.
A eficácia da administração de medicamentos magnetron depende de muitos fatores: as características do próprio transportador magnético e as características da fonte do campo magnético (incluindo os parâmetros geométricos dos ímãs permanentes e a força do campo magnético que eles geram).O desenvolvimento de uma tecnologia bem-sucedida de administração de inibidores celulares guiados magneticamente deve envolver o desenvolvimento de transportadores de medicamentos em nanoescala magnética apropriados, avaliando sua segurança e desenvolvendo um protocolo de visualização que permita rastrear seus movimentos no corpo.
Neste estudo, calculamos matematicamente as características ideais do campo magnético para controlar o transportador magnético de drogas em nanoescala no corpo.A possibilidade de retenção de MNP através da parede do vaso sanguíneo sob a influência de um campo magnético aplicado com estas características computacionais também foi estudada em vasos sanguíneos isolados de ratos.Além disso, sintetizamos conjugados de MNPs e agentes fluorescentes e desenvolvemos um protocolo para sua visualização in vivo.Sob condições in vivo, em camundongos modelo tumoral, foi estudada a eficiência de acumulação de MNPs em tecidos tumorais quando administradas sistemicamente sob a influência de um campo magnético.
No estudo in vitro utilizamos o MNP de referência e no estudo in vivo utilizamos o MNP revestido com poliéster de ácido láctico (ácido polilático, PLA) contendo um agente fluorescente (indolecianina; ICG).MNP-ICG está incluído no caso, use (MNP-PLA-EDA-ICG).
A síntese e as propriedades físicas e químicas do MNP foram descritas em detalhes em outros lugares.7,8
Para sintetizar MNPs-ICG, foram produzidos primeiro conjugados PLA-ICG.Foi utilizada uma mistura racêmica em pó de PLA-D e PLA-L com peso molecular de 60 kDa.
Como o PLA e o ICG são ambos ácidos, para sintetizar os conjugados PLA-ICG, primeiro é necessário sintetizar um espaçador terminado em amino no PLA, o que ajuda o ICG a ser quimicamente absorvido pelo espaçador.O espaçador foi sintetizado utilizando etilenodiamina (EDA), método de carbodiimida e carbodiimida solúvel em água, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC).O espaçador PLA-EDA é sintetizado como segue.Adicione excesso molar de 20 vezes de EDA e excesso molar de 20 vezes de EDAC a 2 mL de solução de clorofórmio PLA 0,1 g/mL.A síntese foi realizada em tubo de ensaio de polipropileno de 15 mL em shaker com velocidade de 300 min-1 por 2 horas.O esquema de síntese é mostrado na Figura 1. Repita a síntese com um excesso de 200 vezes de reagentes para otimizar o esquema de síntese.
Ao final da síntese, a solução foi centrifugada a uma velocidade de 3.000 min-1 por 5 minutos para remover o excesso de derivados de polietileno precipitados.Em seguida, 2 mL de uma solução de ICG 0,5 mg/mL em dimetilsulfóxido (DMSO) foram adicionados à solução de 2 mL.O agitador é fixado a uma velocidade de agitação de 300 min-1 durante 2 horas.O diagrama esquemático do conjugado obtido é mostrado na Figura 2.
Em 200 mg de MNP, adicionamos 4 mL de conjugado PLA-EDA-ICG.Utilize um agitador LS-220 (LOIP, Rússia) para agitar a suspensão durante 30 minutos a uma frequência de 300 min-1.Em seguida, foi lavado três vezes com isopropanol e submetido à separação magnética.Use o Dispersor Ultrassônico UZD-2 (FSUE NII TVCH, Rússia) para adicionar IPA à suspensão por 5 a 10 minutos sob ação ultrassônica contínua.Após a terceira lavagem com IPA, o precipitado foi lavado com água destilada e ressuspenso em soro fisiológico na concentração de 2 mg/mL.
O equipamento ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, UK) foi utilizado para estudar a distribuição de tamanho do MNP obtido na solução aquosa.Um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) com um cátodo de emissão de campo JEM-1400 STEM (JEOL, Japão) foi usado para estudar a forma e o tamanho do MNP.
Neste estudo, utilizamos ímãs permanentes cilíndricos (grau N35; com revestimento protetor de níquel) e os seguintes tamanhos padrão (comprimento do eixo longo × diâmetro do cilindro): 0,5×2 mm, 2×2 mm, 3×2 mm e 5×2 milímetros.
O estudo in vitro do transporte de MNP no sistema modelo foi realizado em uma estrutura hidrodinâmica desenvolvida pelo Instituto de Medicina Experimental do Centro de Pesquisa Médica do Estado Almazov do Ministério da Saúde da Rússia.O volume do líquido circulante (água destilada ou solução de Krebs-Henseleit) é de 225 mL.Ímãs cilíndricos magnetizados axialmente são usados ​​como ímãs permanentes.Coloque o ímã em um suporte a 1,5 mm de distância da parede interna do tubo de vidro central, com sua extremidade voltada para a direção do tubo (vertical).A vazão do fluido no circuito fechado é de 60 L/h (correspondendo a uma velocidade linear de 0,225 m/s).A solução de Krebs-Henseleit é usada como fluido circulante porque é um análogo do plasma.O coeficiente de viscosidade dinâmica do plasma é 1,1–1,3 mPa∙s.9 A quantidade de MNP adsorvida no campo magnético é determinada por espectrofotometria a partir da concentração de ferro no líquido circulante após o experimento.
Além disso, foram realizados estudos experimentais numa tabela melhorada de mecânica dos fluidos para determinar a permeabilidade relativa dos vasos sanguíneos.Os principais componentes do suporte hidrodinâmico são mostrados na Figura 3. Os principais componentes do stent hidrodinâmico são um circuito fechado que simula a seção transversal do sistema vascular modelo e um tanque de armazenamento.O movimento do fluido modelo ao longo do contorno do módulo do vaso sanguíneo é fornecido por uma bomba peristáltica.Durante o experimento, mantenha a vaporização e a faixa de temperatura necessária e monitore os parâmetros do sistema (temperatura, pressão, vazão de líquido e valor de pH).
Figura 3 Diagrama de blocos do setup utilizado para estudar a permeabilidade da parede da artéria carótida.1 tanque de armazenamento, 2 bombas peristálticas, 3 mecanismos de introdução de suspensão contendo MNP no circuito, 4 medidores de vazão, 5 sensores de pressão no circuito, 6 trocadores de calor, 7 câmaras com recipiente, 8 fontes do campo magnético, 9-o balão com hidrocarbonetos.
A câmara que contém o recipiente é composta por três recipientes: um recipiente exterior grande e dois recipientes pequenos, através dos quais passam os braços do circuito central.A cânula é inserida no recipiente pequeno, o recipiente é amarrado no recipiente pequeno e a ponta da cânula é firmemente amarrada com um fio fino.O espaço entre o recipiente grande e o recipiente pequeno é preenchido com água destilada e a temperatura permanece constante devido à ligação ao permutador de calor.O espaço no pequeno recipiente é preenchido com solução de Krebs-Henseleit para manter a viabilidade das células dos vasos sanguíneos.O tanque também é preenchido com solução de Krebs-Henseleit.O sistema de fornecimento de gás (carbono) é utilizado para vaporizar a solução no pequeno recipiente do tanque de armazenamento e na câmara que contém o recipiente (Figura 4).
Figura 4 Câmara onde é colocado o recipiente.1-Cânula para redução de vasos sanguíneos, 2-Câmara externa, 3-Câmara pequena.A seta indica a direção do fluido do modelo.
Para determinar o índice de permeabilidade relativa da parede do vaso, utilizou-se a artéria carótida de rato.
A introdução da suspensão MNP (0,5mL) no sistema possui as seguintes características: o volume interno total do tanque e tubo de ligação na alça é de 20mL, e o volume interno de cada câmara é de 120mL.A fonte externa do campo magnético é um ímã permanente com tamanho padrão de 2×3 mm.É instalado acima de uma das pequenas câmaras, a 1 cm de distância do contêiner, com uma das extremidades voltada para a parede do contêiner.A temperatura é mantida em 37°C.A potência da bomba de rolos está regulada para 50%, o que corresponde a uma velocidade de 17 cm/s.Como controle, as amostras foram coletadas em uma célula sem ímãs permanentes.
Uma hora após a administração de uma determinada concentração de MNP, uma amostra líquida foi retirada da câmara.A concentração de partículas foi medida por um espectrofotômetro utilizando espectrofotômetro UV-Vis Unico 2802S (United Products & Instruments, EUA).Tendo em conta o espectro de absorção da suspensão MNP, a medição foi realizada a 450 nm.
De acordo com as diretrizes Rus-LASA-FELASA, todos os animais são criados e criados em instalações específicas livres de patógenos.Este estudo está em conformidade com todos os regulamentos éticos relevantes para experimentos e pesquisas com animais e obteve aprovação ética do Centro Nacional de Pesquisa Médica Almazov (IACUC).Os animais beberam água ad libitum e alimentaram-se regularmente.
O estudo foi realizado em 10 camundongos NSG imunodeficientes, machos, anestesiados, com 12 semanas de idade (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, EUA) 10, pesando 22 g ± 10%.Uma vez que a imunidade dos ratos com imunodeficiência é suprimida, os ratos com imunodeficiência desta linha permitem o transplante de células e tecidos humanos sem rejeição do transplante.Os irmãos de diferentes gaiolas foram distribuídos aleatoriamente para o grupo experimental e foram co-criados ou sistematicamente expostos à cama de outros grupos para garantir exposição igual à microbiota comum.
A linha celular de câncer humano HeLa é usada para estabelecer um modelo de xenoenxerto.As células foram cultivadas em DMEM contendo glutamina (PanEco, Rússia), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, EUA), 100 UFC/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.A linhagem celular foi gentilmente cedida pelo Laboratório de Regulação da Expressão Gênica do Instituto de Pesquisa Celular da Academia Russa de Ciências.Antes da injeção, as células HeLa foram removidas do plástico de cultura com uma solução 1:1 de tripsina: Versene (Biolot, Rússia).Após a lavagem, as células foram suspensas em meio completo até uma concentração de 5x106 células por 200 μL e diluídas com matriz de membrana basal (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, em gelo).A suspensão celular preparada foi injetada subcutaneamente na pele da coxa do camundongo.Use paquímetros eletrônicos para monitorar o crescimento do tumor a cada 3 dias.
Quando o tumor atingiu 500 mm3, um ímã permanente foi implantado no tecido muscular do animal experimental próximo ao tumor.No grupo experimental (MNPs-ICG + tumor-M), 0,1 mL de suspensão de MNP foram injetados e expostos a um campo magnético.Animais inteiros não tratados foram utilizados como controles (fundo).Além disso, foram utilizados animais injetados com 0,1 mL de MNP, mas não implantados com ímãs (MNPs-ICG + tumor-BM).
A visualização da fluorescência de amostras in vivo e in vitro foi realizada no bioimager IVIS Lumina LT série III (PerkinElmer Inc., EUA).Para visualização in vitro, um volume de 1 mL de conjugado sintético PLA-EDA-ICG e MNP-PLA-EDA-ICG foi adicionado aos poços da placa.Levando em consideração as características de fluorescência do corante ICG, é selecionado o melhor filtro utilizado para determinar a intensidade luminosa da amostra: o comprimento de onda máximo de excitação é 745 nm e o comprimento de onda de emissão é 815 nm.O software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) foi utilizado para medir quantitativamente a intensidade de fluorescência dos poços contendo o conjugado.
A intensidade de fluorescência e o acúmulo do conjugado MNP-PLA-EDA-ICG foram medidos em camundongos modelo tumoral in vivo, sem a presença e aplicação de campo magnético no local de interesse.Os camundongos foram anestesiados com isoflurano e, em seguida, 0,1 mL de conjugado MNP-PLA-EDA-ICG foram injetados através da veia caudal.Camundongos não tratados foram utilizados como controle negativo para obter um fundo fluorescente.Depois de administrar o conjugado por via intravenosa, coloque o animal em um estágio de aquecimento (37°C) na câmara do gerador de imagens de fluorescência IVIS Lumina LT série III (PerkinElmer Inc.) enquanto mantém a inalação com anestesia com isoflurano a 2%.Use o filtro integrado do ICG (745–815 nm) para detecção de sinal 1 minuto e 15 minutos após a introdução do MNP.
Para avaliar o acúmulo de conjugado no tumor, a região peritoneal do animal foi coberta com papel, o que possibilitou eliminar a fluorescência brilhante associada ao acúmulo de partículas no fígado.Após estudar a biodistribuição de MNP-PLA-EDA-ICG, os animais foram sacrificados humanamente por overdose de anestesia com isoflurano para posterior separação das áreas tumorais e avaliação quantitativa da radiação fluorescente.Use o software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) para processar manualmente a análise do sinal da região de interesse selecionada.Foram realizadas três medidas para cada animal (n = 9).
Neste estudo, não quantificamos o carregamento bem-sucedido do ICG nas MNPs-ICG.Além disso, não comparamos a eficiência de retenção de nanopartículas sob a influência de ímãs permanentes de diferentes formatos.Além disso, não avaliamos o efeito a longo prazo do campo magnético na retenção de nanopartículas em tecidos tumorais.
As nanopartículas dominam, com tamanho médio de 195,4 nm.Além disso, a suspensão continha aglomerados com tamanho médio de 1176,0 nm (Figura 5A).Posteriormente, a porção foi filtrada através de filtro centrífugo.O potencial zeta das partículas é de -15,69 mV (Figura 5B).
Figura 5 As propriedades físicas da suspensão: (A) distribuição do tamanho das partículas;(B) distribuição de partículas no potencial zeta;(C) fotografia TEM de nanopartículas.
O tamanho da partícula é basicamente 200 nm (Figura 5C), composto por um único MNP com tamanho de 20 nm e uma camada orgânica conjugada com PLA-EDA-ICG com menor densidade eletrônica.A formação de aglomerados em soluções aquosas pode ser explicada pelo módulo relativamente baixo da força eletromotriz das nanopartículas individuais.
Para ímãs permanentes, quando a magnetização está concentrada no volume V, a expressão integral é dividida em duas integrais, a saber, o volume e a superfície:
No caso de uma amostra com magnetização constante, a densidade de corrente é zero.Então, a expressão do vetor de indução magnética terá a seguinte forma:
Use o programa MATLAB (MathWorks, Inc., EUA) para cálculo numérico, licença acadêmica ETU “LETI” número 40502181.
Conforme mostrado na Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10, o campo magnético mais forte é gerado por um ímã orientado axialmente a partir da extremidade do cilindro.O raio de ação efetivo é equivalente à geometria do ímã.Em ímãs cilíndricos com cilindro cujo comprimento é maior que seu diâmetro, o campo magnético mais forte é observado na direção axial-radial (para o componente correspondente);portanto, um par de cilindros com maior proporção de aspecto (diâmetro e comprimento) de adsorção de MNP é o mais eficaz.
Fig. 7 A componente da intensidade de indução magnética Bz ao longo do eixo Oz do íman;o tamanho padrão do ímã: linha preta 0,5×2mm, linha azul 2×2mm, linha verde 3×2mm, linha vermelha 5×2mm.
Figura 8 A componente de indução magnética Br é perpendicular ao eixo magnético Oz;o tamanho padrão do ímã: linha preta 0,5×2mm, linha azul 2×2mm, linha verde 3×2mm, linha vermelha 5×2mm.
Figura 9 Componente Bz da intensidade da indução magnética à distância r do eixo final do ímã (z=0);o tamanho padrão do ímã: linha preta 0,5×2mm, linha azul 2×2mm, linha verde 3×2mm, linha vermelha 5×2mm.
Figura 10 Componente de indução magnética ao longo da direção radial;tamanho padrão do ímã: linha preta 0,5×2mm, linha azul 2×2mm, linha verde 3×2mm, linha vermelha 5×2mm.
Modelos hidrodinâmicos especiais podem ser usados ​​para estudar o método de entrega de MNP aos tecidos tumorais, concentrar nanopartículas na área alvo e determinar o comportamento das nanopartículas sob condições hidrodinâmicas no sistema circulatório.Os ímãs permanentes podem ser usados ​​como campos magnéticos externos.Se ignorarmos a interação magnetostática entre as nanopartículas e não considerarmos o modelo de fluido magnético, é suficiente estimar a interação entre o ímã e uma única nanopartícula com uma aproximação dipolo-dipolo.
Onde m é o momento magnético do ímã, r é o vetor raio do ponto onde a nanopartícula está localizada e k é o fator do sistema.Na aproximação dipolo, o campo do ímã tem configuração semelhante (Figura 11).
Num campo magnético uniforme, as nanopartículas giram apenas ao longo das linhas de força.Em um campo magnético não uniforme, a força atua sobre ele:
Onde está a derivada de uma determinada direção l.Além disso, a força puxa as nanopartículas para as áreas mais irregulares do campo, ou seja, a curvatura e a densidade das linhas de força aumentam.
Portanto, é desejável usar um ímã suficientemente forte (ou cadeia magnética) com anisotropia axial óbvia na área onde as partículas estão localizadas.
A Tabela 1 mostra a capacidade de um único ímã como fonte de campo magnético suficiente para capturar e reter MNP no leito vascular do campo de aplicação.