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Controlar o movimento de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro para a administração direcionada de citostáticos.
Autor Toropova Y, Korolev D, Istomina M, Shulmeyster G, Petukhov A, Mishanin V, Gorshkov A, Podyacheva E, Gareev K, Bagrov A, Demidov O
Yana Toropova,1 Dmitry Korolev,1 Maria Istomina,1,2 Galina Shulmeyster,1 Alexey Petukhov,1,3 Vladimir Mishanin,1 Andrey Gorshkov,4 Ekaterina Podyacheva,1 Kamil Gareev,2 Alexei Bagrov,5 Oleg Demidov6,71Centro Nacional de Pesquisa Médica Almazov do Ministério da Saúde da Federação Russa, São Petersburgo, 197341, Federação Russa; 2 Universidade Eletrotécnica de São Petersburgo “LETI”, São Petersburgo, 197376, Federação Russa; 3 Centro de Medicina Personalizada, Centro Estadual de Pesquisa Médica Almazov, Ministério da Saúde da Federação Russa, São Petersburgo, 197341, Federação Russa; 4FSBI “Instituto de Pesquisa da Influenza AA Smorodintsev”, Ministério da Saúde da Federação Russa, São Petersburgo, Federação Russa; 5 Instituto Sechenov de Fisiologia Evolutiva e Bioquímica, Academia Russa de Ciências, São Petersburgo, Federação Russa; 6 Instituto de Citologia da Academia Russa de Ciências, São Petersburgo, 194064, Federação Russa; 7INSERM U1231, Faculdade de Medicina e Farmácia, Universidade Bourgogne-Franche-Comté de Dijon, França. Comunicação: Yana Toropova, Centro Nacional de Pesquisa Médica Almazov, Ministério da Saúde da Federação Russa, São Petersburgo, 197341, Federação Russa. Tel.: +7 981 95264800 4997069. E-mail: [email protected] Contexto: Uma abordagem promissora para o problema da toxicidade citostática é o uso de nanopartículas magnéticas (NPM) para a administração direcionada de fármacos. Objetivo: Utilizar cálculos para determinar as melhores características do campo magnético que controla as NPM in vivo e avaliar a eficiência da administração de NPM por magnetron em tumores de camundongos in vitro e in vivo. Estudos de intensidade de luminescência in vivo foram realizados em camundongos com tumores, com e sem campo magnético no local de interesse. Estes estudos foram realizados em um arcabouço hidrodinâmico desenvolvido pelo Instituto de Medicina Experimental do Centro Estatal de Pesquisa Médica Almazov do Ministério da Saúde da Rússia. Resultado: O uso de ímãs de neodímio promoveu o acúmulo seletivo de nanopartículas magnéticas (MNPs). Um minuto após a administração de MNPs-ICG em camundongos com tumores, as MNPs-ICG se acumularam principalmente no fígado. Isso indica sua via metabólica tanto na ausência quanto na presença de um campo magnético. Embora tenha sido observado um aumento na fluorescência no tumor na presença de um campo magnético, a intensidade da fluorescência no fígado do animal não se alterou ao longo do tempo. Conclusão: Este tipo de MNP, combinado com a intensidade do campo magnético calculada, pode servir de base para o desenvolvimento de sistemas de liberação controlada magneticamente de fármacos citostáticos para tecidos tumorais. Palavras-chave: análise de fluorescência, indocianina, nanopartículas de óxido de ferro, liberação de citostáticos por magnetron, direcionamento tumoral.
As doenças tumorais são uma das principais causas de morte em todo o mundo. Ao mesmo tempo, a dinâmica de aumento da morbidade e mortalidade associadas a esses tumores persiste.¹ A quimioterapia, utilizada atualmente, continua sendo um dos principais tratamentos para diferentes tipos de tumores. Nesse contexto, o desenvolvimento de métodos para reduzir a toxicidade sistêmica dos agentes citostáticos permanece relevante. Um método promissor para solucionar esse problema é a utilização de carreadores em nanoescala para direcionar a administração de fármacos, o que permite o acúmulo local dos medicamentos nos tecidos tumorais sem aumentar sua concentração em órgãos e tecidos saudáveis.² Esse método possibilita melhorar a eficácia e o direcionamento dos quimioterápicos aos tecidos tumorais, reduzindo sua toxicidade sistêmica.
Dentre as diversas nanopartículas consideradas para a administração direcionada de agentes citostáticos, as nanopartículas magnéticas (MNPs) são de particular interesse devido às suas propriedades químicas, biológicas e magnéticas únicas, que garantem sua versatilidade. Portanto, as nanopartículas magnéticas podem ser utilizadas como um sistema de aquecimento para tratar tumores com hipertermia (hipertermia magnética). Elas também podem ser utilizadas como agentes de diagnóstico (diagnóstico por ressonância magnética).^3-5 Utilizando essas características, combinadas com a possibilidade de acúmulo de MNPs em uma área específica, por meio do uso de um campo magnético externo, a administração direcionada de preparações farmacêuticas abre perspectivas para a criação de um sistema magnetron multifuncional para direcionar citostáticos ao local do tumor. Tal sistema incluiria MNPs e campos magnéticos para controlar seu movimento no corpo. Nesse caso, tanto campos magnéticos externos quanto implantes magnéticos colocados na área do corpo que contém o tumor podem ser utilizados como fonte do campo magnético.⁶ O primeiro método apresenta sérias desvantagens, incluindo a necessidade de utilizar equipamentos especializados para o direcionamento magnético de fármacos e a necessidade de treinar pessoal para realizar a cirurgia. Além disso, esse método é limitado pelo alto custo e é adequado apenas para tumores “superficiais” próximos à superfície do corpo. O método alternativo de uso de implantes magnéticos amplia o escopo de aplicação dessa tecnologia, facilitando seu uso em tumores localizados em diferentes partes do corpo. Tanto ímãs individuais quanto ímãs integrados ao stent intraluminal podem ser usados ​​como implantes para danos tumorais em órgãos ocos, garantindo sua permeabilidade. No entanto, de acordo com nossa pesquisa ainda não publicada, esses implantes não são suficientemente magnéticos para garantir a retenção de nanopartículas magnéticas (MNP) na corrente sanguínea.
A eficácia da administração de fármacos por magnetron depende de muitos fatores: as características do próprio vetor magnético e as características da fonte do campo magnético (incluindo os parâmetros geométricos dos ímãs permanentes e a intensidade do campo magnético que geram). O desenvolvimento de uma tecnologia bem-sucedida de administração de inibidores celulares guiada magneticamente deve envolver o desenvolvimento de vetores magnéticos em nanoescala adequados, a avaliação de sua segurança e o desenvolvimento de um protocolo de visualização que permita rastrear seus movimentos no organismo.
Neste estudo, calculamos matematicamente as características ideais do campo magnético para controlar o transporte de fármacos em nanoescala por meio de nanopartículas magnéticas no organismo. A possibilidade de retenção de nanopartículas magnéticas através da parede do vaso sanguíneo sob a influência de um campo magnético aplicado, com base nessas características computacionais, também foi estudada em vasos sanguíneos isolados de ratos. Além disso, sintetizamos conjugados de nanopartículas magnéticas e agentes fluorescentes e desenvolvemos um protocolo para sua visualização in vivo. Em condições in vivo, em camundongos com modelo tumoral, estudamos a eficiência de acúmulo de nanopartículas magnéticas em tecidos tumorais quando administradas sistemicamente sob a influência de um campo magnético.
No estudo in vitro, utilizamos as MNP de referência e, no estudo in vivo, utilizamos as MNP revestidas com poliéster de ácido lático (ácido polilático, PLA) contendo um agente fluorescente (indolcianina; ICG). Neste caso, utilize (MNP-PLA-EDA-ICG).
A síntese e as propriedades físico-químicas das MNP foram descritas detalhadamente em outros trabalhos. 7,8
Para sintetizar MNPs-ICG, conjugados de PLA-ICG foram produzidos inicialmente. Uma mistura racêmica em pó de PLA-D e PLA-L com peso molecular de 60 kDa foi utilizada.
Como o PLA e o ICG são ambos ácidos, para sintetizar os conjugados PLA-ICG, é necessário primeiro sintetizar um espaçador com terminação amino no PLA, que auxilia na quimissorção do ICG ao espaçador. O espaçador foi sintetizado utilizando etilenodiamina (EDA), o método da carbodiimida e a carbodiimida solúvel em água, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC). O espaçador PLA-EDA foi sintetizado da seguinte forma: adicionou-se um excesso molar de 20 vezes de EDA e um excesso molar de 20 vezes de EDAC a 2 mL de solução de PLA em clorofórmio a 0,1 g/mL. A síntese foi realizada em um tubo de ensaio de polipropileno de 15 mL, sob agitação a 300 rpm, durante 2 horas. O esquema de síntese é mostrado na Figura 1. A síntese foi repetida com um excesso de 200 vezes de reagentes para otimizar o esquema de síntese.
Ao final da síntese, a solução foi centrifugada a 3000 rpm por 5 minutos para remover o excesso de derivados de polietileno precipitados. Em seguida, 2 mL de uma solução de ICG a 0,5 mg/mL em dimetilsulfóxido (DMSO) foram adicionados aos 2 mL da solução. A agitação foi mantida a 300 rpm por 2 horas. O diagrama esquemático do conjugado obtido é mostrado na Figura 2.
Em 200 mg de MNP, adicionamos 4 mL do conjugado PLA-EDA-ICG. Utilizamos um agitador LS-220 (LOIP, Rússia) para agitar a suspensão por 30 minutos a uma frequência de 300 rpm. Em seguida, lavamos a suspensão três vezes com isopropanol e a submetemos à separação magnética. Utilizamos um dispersor ultrassônico UZD-2 (FSUE NII TVCH, Rússia) para adicionar IPA à suspensão por 5 a 10 minutos sob ação ultrassônica contínua. Após a terceira lavagem com IPA, o precipitado foi lavado com água destilada e ressuspenso em solução salina fisiológica a uma concentração de 2 mg/mL.
O equipamento ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, Reino Unido) foi utilizado para estudar a distribuição de tamanho das MNP obtidas em solução aquosa. Um microscópio eletrônico de transmissão (MET) com cátodo de emissão de campo JEM-1400 STEM (JEOL, Japão) foi utilizado para estudar a forma e o tamanho das MNP.
Neste estudo, utilizamos ímãs permanentes cilíndricos (grau N35; com revestimento protetor de níquel) e os seguintes tamanhos padrão (comprimento do eixo maior × diâmetro do cilindro): 0,5×2 mm, 2×2 mm, 3×2 mm e 5×2 mm.
O estudo in vitro do transporte de nanopartículas magnéticas (MNP) no sistema modelo foi realizado em um suporte hidrodinâmico desenvolvido pelo Instituto de Medicina Experimental do Centro Estatal de Pesquisa Médica Almazov do Ministério da Saúde da Rússia. O volume do líquido circulante (água destilada ou solução de Krebs-Henseleit) é de 225 mL. Ímãs cilíndricos axialmente magnetizados são usados ​​como ímãs permanentes. O ímã é posicionado em um suporte a 1,5 mm da parede interna do tubo de vidro central, com sua extremidade voltada para a direção do tubo (vertical). A vazão do fluido no circuito fechado é de 60 L/h (correspondendo a uma velocidade linear de 0,225 m/s). A solução de Krebs-Henseleit é usada como fluido circulante por ser análoga ao plasma. O coeficiente de viscosidade dinâmica do plasma é de 1,1–1,3 mPa∙s.⁹ A quantidade de MNP adsorvida no campo magnético é determinada por espectrofotometria a partir da concentração de ferro no líquido circulante após o experimento.
Além disso, estudos experimentais foram realizados em uma mesa de mecânica de fluidos aprimorada para determinar a permeabilidade relativa dos vasos sanguíneos. Os principais componentes do suporte hidrodinâmico são mostrados na Figura 3. Os principais componentes do stent hidrodinâmico são um circuito fechado que simula a seção transversal do modelo do sistema vascular e um tanque de armazenamento. O movimento do fluido do modelo ao longo do contorno do módulo do vaso sanguíneo é fornecido por uma bomba peristáltica. Durante o experimento, a vaporização e a faixa de temperatura desejada são mantidas, e os parâmetros do sistema (temperatura, pressão, vazão do líquido e valor de pH) são monitorados.
Figura 3. Diagrama de blocos da montagem utilizada para estudar a permeabilidade da parede da artéria carótida. 1-tanque de armazenamento, 2-bomba peristáltica, 3-mecanismo para introdução da suspensão contendo MNP no circuito, 4-medidor de fluxo, 5-sensor de pressão no circuito, 6-trocador de calor, 7-câmara com recipiente, 8-fonte do campo magnético, 9-balão com hidrocarbonetos.
A câmara que contém o recipiente é composta por três recipientes: um recipiente externo grande e dois recipientes menores, pelos quais passam os braços do circuito central. A cânula é inserida no recipiente menor, o recipiente é conectado ao recipiente menor e a ponta da cânula é firmemente presa com um fio fino. O espaço entre o recipiente grande e o recipiente menor é preenchido com água destilada, e a temperatura permanece constante devido à conexão com o trocador de calor. O espaço no recipiente menor é preenchido com solução de Krebs-Henseleit para manter a viabilidade das células dos vasos sanguíneos. O tanque também é preenchido com solução de Krebs-Henseleit. O sistema de fornecimento de gás (carbono) é usado para vaporizar a solução no recipiente menor, no tanque de armazenamento e na câmara que contém o recipiente (Figura 4).
Figura 4. Câmara onde o recipiente é colocado. 1-Cânula para baixar os vasos sanguíneos, 2-Câmara externa, 3-Câmara pequena. A seta indica a direção do fluido do modelo.
Para determinar o índice de permeabilidade relativa da parede do vaso, foi utilizada a artéria carótida de rato.
A introdução da suspensão de MNP (0,5 mL) no sistema apresenta as seguintes características: o volume interno total do tanque e do tubo de conexão no circuito é de 20 mL, e o volume interno de cada câmara é de 120 mL. A fonte de campo magnético externo é um ímã permanente com dimensões padrão de 2 × 3 mm. Ele é instalado acima de uma das câmaras menores, a 1 cm da parede do recipiente, com uma extremidade voltada para a parede do recipiente. A temperatura é mantida a 37 °C. A potência da bomba peristáltica é ajustada para 50%, o que corresponde a uma velocidade de 17 cm/s. Como controle, amostras foram coletadas em uma célula sem ímãs permanentes.
Uma hora após a administração de uma determinada concentração de MNP, uma amostra líquida foi coletada da câmara. A concentração de partículas foi medida por espectrofotometria utilizando um espectrofotômetro UV-Vis Unico 2802S (United Products & Instruments, EUA). Levando em consideração o espectro de absorção da suspensão de MNP, a medição foi realizada em 450 nm.
De acordo com as diretrizes Rus-LASA-FELASA, todos os animais foram criados em instalações livres de patógenos específicos. Este estudo está em conformidade com todas as normas éticas relevantes para experimentação e pesquisa com animais e obteve aprovação ética do Centro Nacional de Pesquisa Médica Almazov (IACUC). Os animais tiveram água à vontade e foram alimentados regularmente.
O estudo foi conduzido em 10 camundongos NSG machos imunodeficientes de 12 semanas de idade (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, EUA), com peso de 22 g ± 10%. Como a imunidade dos camundongos imunodeficientes é suprimida, essa linhagem permite o transplante de células e tecidos humanos sem rejeição. Os animais da mesma ninhada, provenientes de diferentes gaiolas, foram aleatoriamente designados para o grupo experimental e cruzados entre si ou expostos sistematicamente à cama de outros grupos para garantir exposição igual à microbiota comum.
A linhagem celular de câncer humano HeLa foi utilizada para estabelecer um modelo de xenotransplante. As células foram cultivadas em DMEM contendo glutamina (PanEco, Rússia), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, EUA), 100 UFC/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. A linhagem celular foi gentilmente cedida pelo Laboratório de Regulação da Expressão Gênica do Instituto de Pesquisa Celular da Academia Russa de Ciências. Antes da injeção, as células HeLa foram removidas do plástico de cultura com uma solução de tripsina:Versene 1:1 (Biolot, Rússia). Após lavagem, as células foram suspensas em meio completo até uma concentração de 5×10⁶ células por 200 μL e diluídas com matriz de membrana basal (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, em gelo). A suspensão celular preparada foi injetada por via subcutânea na pele da coxa do camundongo. Utilize um paquímetro eletrônico para monitorar o crescimento do tumor a cada 3 dias.
Quando o tumor atingiu 500 mm³, um ímã permanente foi implantado no tecido muscular do animal experimental próximo ao tumor. No grupo experimental (MNPs-ICG + tumor-M), 0,1 mL de suspensão de MNPs foi injetado e o animal foi exposto a um campo magnético. Animais inteiros não tratados foram utilizados como controle (fundo). Além disso, animais injetados com 0,1 mL de MNPs, mas sem implante de ímãs (MNPs-ICG + tumor-BM), também foram utilizados.
A visualização por fluorescência de amostras in vivo e in vitro foi realizada no bioimager IVIS Lumina LT série III (PerkinElmer Inc., EUA). Para a visualização in vitro, um volume de 1 mL do conjugado sintético PLA-EDA-ICG e MNP-PLA-EDA-ICG foi adicionado aos poços da placa. Levando em consideração as características de fluorescência do corante ICG, o filtro mais adequado para determinar a intensidade luminosa da amostra foi selecionado: comprimento de onda de excitação máximo de 745 nm e comprimento de onda de emissão de 815 nm. O software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) foi utilizado para medir quantitativamente a intensidade de fluorescência dos poços contendo o conjugado.
A intensidade e o acúmulo de fluorescência do conjugado MNP-PLA-EDA-ICG foram medidos em camundongos com modelo tumoral in vivo, sem a presença ou aplicação de um campo magnético no local de interesse. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano e, em seguida, 0,1 mL do conjugado MNP-PLA-EDA-ICG foi injetado na veia da cauda. Camundongos não tratados foram usados ​​como controle negativo para obter um sinal de fundo fluorescente. Após a administração intravenosa do conjugado, o animal foi colocado em uma plataforma aquecida (37 °C) na câmara do sistema de imagem de fluorescência IVIS Lumina LT série III (PerkinElmer Inc.), enquanto a anestesia inalatória com isoflurano a 2% era mantida. O filtro integrado do ICG (745–815 nm) foi utilizado para a detecção do sinal 1 minuto e 15 minutos após a introdução do MNP.
Para avaliar o acúmulo do conjugado no tumor, a área peritoneal do animal foi coberta com papel, o que possibilitou eliminar a fluorescência intensa associada ao acúmulo de partículas no fígado. Após o estudo da biodistribuição de MNP-PLA-EDA-ICG, os animais foram eutanasiados humanitariamente por meio de uma overdose de anestesia com isoflurano para posterior separação das áreas tumorais e avaliação quantitativa da radiação de fluorescência. O software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) foi utilizado para processar manualmente a análise do sinal da região de interesse selecionada. Três medições foram realizadas para cada animal (n = 9).
Neste estudo, não quantificamos o carregamento bem-sucedido de ICG nas MNPs-ICG. Além disso, não comparamos a eficiência de retenção das nanopartículas sob a influência de ímãs permanentes de diferentes formatos. Também não avaliamos o efeito a longo prazo do campo magnético na retenção das nanopartículas em tecidos tumorais.
As nanopartículas predominam, com um tamanho médio de 195,4 nm. Além disso, a suspensão continha aglomerados com um tamanho médio de 1176,0 nm (Figura 5A). Posteriormente, a porção foi filtrada através de um filtro centrífugo. O potencial zeta das partículas é de -15,69 mV (Figura 5B).
Figura 5. Propriedades físicas da suspensão: (A) distribuição do tamanho das partículas; (B) distribuição das partículas no potencial zeta; (C) fotografia TEM das nanopartículas.
O tamanho das partículas é basicamente de 200 nm (Figura 5C), composto por uma única MNP com tamanho de 20 nm e uma camada orgânica conjugada de PLA-EDA-ICG com menor densidade eletrônica. A formação de aglomerados em soluções aquosas pode ser explicada pelo módulo relativamente baixo da força eletromotriz das nanopartículas individuais.
Para ímãs permanentes, quando a magnetização está concentrada no volume V, a expressão integral é dividida em duas integrais, a saber, a integral de volume e a integral de superfície:
No caso de uma amostra com magnetização constante, a densidade de corrente é zero. Então, a expressão do vetor de indução magnética assumirá a seguinte forma:
Utilize o programa MATLAB (MathWorks, Inc., EUA) para cálculos numéricos, licença acadêmica ETU “LETI” número 40502181.
Como mostrado nas Figuras 7, 8, 9 e 10, o campo magnético mais forte é gerado por um ímã orientado axialmente a partir da extremidade do cilindro. O raio de ação efetivo é equivalente à geometria do ímã. Em ímãs cilíndricos com um cilindro cujo comprimento é maior que seu diâmetro, o campo magnético mais forte é observado na direção axial-radial (para a componente correspondente); portanto, a adsorção de nanopartículas magnéticas (MNP) é mais eficaz em um par de cilindros com uma maior relação de aspecto (diâmetro e comprimento).
Figura 7. Componente da intensidade de indução magnética Bz ao longo do eixo Oz do ímã; dimensões padrão do ímã: linha preta 0,5×2mm, linha azul 2×2mm, linha verde 3×2mm, linha vermelha 5×2mm.
Figura 8. O componente de indução magnética Br é perpendicular ao eixo do ímã Oz; tamanho padrão do ímã: linha preta 0,5×2mm, linha azul 2×2mm, linha verde 3×2mm, linha vermelha 5×2mm.
Figura 9. Componente Bz da intensidade de indução magnética a uma distância r do eixo final do ímã (z=0); dimensões padrão do ímã: linha preta 0,5×2mm, linha azul 2×2mm, linha verde 3×2mm, linha vermelha 5×2mm.
Figura 10 Componente de indução magnética na direção radial; tamanho padrão do ímã: linha preta 0,5×2mm, linha azul 2×2mm, linha verde 3×2mm, linha vermelha 5×2mm.
Modelos hidrodinâmicos especiais podem ser usados ​​para estudar o método de administração de nanopartículas magnéticas (MNP) a tecidos tumorais, concentrar nanopartículas na área alvo e determinar o comportamento das nanopartículas sob condições hidrodinâmicas no sistema circulatório. Ímãs permanentes podem ser usados ​​como campos magnéticos externos. Se ignorarmos a interação magnetostática entre as nanopartículas e não considerarmos o modelo de fluido magnético, é suficiente estimar a interação entre o ímã e uma única nanopartícula com uma aproximação dipolo-dipolo.
Onde m é o momento magnético do ímã, r é o vetor raio do ponto onde a nanopartícula está localizada e k é o fator do sistema. Na aproximação dipolar, o campo do ímã tem uma configuração semelhante (Figura 11).
Em um campo magnético uniforme, as nanopartículas giram apenas ao longo das linhas de força. Em um campo magnético não uniforme, a força atua sobre elas:
Onde está a derivada de uma determinada direção l? Além disso, a força puxa as nanopartículas para as áreas mais irregulares do campo, ou seja, a curvatura e a densidade das linhas de força aumentam.
Portanto, é desejável usar um ímã (ou cadeia de ímãs) suficientemente forte com anisotropia axial evidente na área onde as partículas estão localizadas.
A Tabela 1 mostra a capacidade de um único ímã como fonte de campo magnético suficiente para capturar e reter MNP no leito vascular do campo de aplicação.